1. 통합생물정보데이터베이스 구축 및 항암제 표적유전자 screening system 구축

표적유전자의 탐색의 중요성
전통적인 신약개발에서는 특정 세포기능의 경로에서 중요하게 작용하는 단백질의 조절제를 사용해 왔다. 그러나 세포기능에는 여러 가지 조절경로가 동시에 작용하고 있으며 한 조절 경로가 막혔을 때 다른 조절 경로가 이를 극복하기 위해 활성화 되거나 기능이 변화되어 정상상태와 다른 세포의 기능변화를 가져온다. 이러한 세포기능조절 경로의 중복성 내지는 불확실성 때문에 기존의 접근 방법으로 개발된 신약은 효능이 떨어지거나 부작용이 생기는 경우가 많았다.
2000년대의 신약개발의 특징은 신규 표적 특이적 신약개발 패턴이다. 질병특이적 표적유전자에만 작용하는 신약을 개발하여 부작용은 줄이고 효과는 극대화하고자 한다. 최근 "targeted therapy"의 개념이 암치료의 중심으로 부각되고 있다. 이는 Gleevec, Irresa, Tarceva, Rituxan, Herceptin 등 현재 각광받고 있는 새로운 암 치료제가 대부분 특정단백들 표적으로 하는 선택적 약물들이기 때문이다. 신약개발 표적은 질병기전의 분자 수준의 이해 증가와 함께 매우 가능성 있는 새로운 것들이 많이 제시되었다. 신약 개발 표적의 결정시, 새로운 질병 표적의 표적으로서의 초기 신뢰도는 신약개발기간의 최소 5년 이상의 시간과 수 천억원이 소용된다는 점에서 매우 중요하다. 따라서 신약 개발 시 확실한 치료 효과를 보여 줄 수 있는 표적의 선택이 필요하다.

2차 데이터베이스 구축의 필요성
각종 -omics 에 의한 유전체 단위의 대규모 생물정보들은 표적 유전자 screening을 위한 중요한 1차 자료로 유용하다. 이러한 1차 정보 자체를 생산하기위해서는 막대한 자본과 인력이 필요한데, 상대적으로 자본과 인력의 수급이 충분하지 못한 한국의 현재 실정에는 이미 구축된 1차 생물정보 데이터베이스를 고급 과학인력을 이용하여 분석, 재해석한 2차 데이터베이스를 구축하는 것에 중심을 두는 것이 안정적이다. 1차 데이터베이스인 각종 platform의 expression profile들을 총체적으로 통합, 분석하여 유용한 표적 유전자를 발굴하는 것은 신약개발을 위한 효율적인 방법론이 될 것으로 생각된다.


연구내용

multi-expression profile 통합
Expression Sequence Tag (EST), Serial Analysis of Gene Expression (SAGE) 와 DNA microarray chip은 transcriptome 수준의 gene expression profile을 얻는 방법이다. 각각의 platform은 모두 transcriptome 수준의 발현량 정보를 얻고자 하는 동일한 목표로 수행되나, 실험상의 artifact 및 systematic bias에 의하여 expression profile의 결과가 동일하지 않은 경우도 종종 있다. 기존의 만들어진 각종 expression DB들이 하나의 platform에 대한 profile 만을 제공하여 platform dependent 한 발현량을 보여주었는데, 각 종 platform을 통합하면 보다 신뢰성있는 정보를 줄 것으로 생각된다. 통합된 expression profile은 새로운 신약개발 (Drug Discovery)을 위한 anti-cancer target gene secreening 뿐 아니라, 질병진단 (Disease Diagnosis), 약품의 효능성 (Pharmaco Genomics), 임상적 안정성 및 독성연구 (Toxigenomics)등에 널리 응용될 수 있을 것으로 기대된다.



통계분석모듈 개발
각종 -omics 정보가 중요하게 떠오르면서, 대용량 생물 정보를 분석하는 통계적 방법이 활발하게 개발되고 있다. 대부분의 expression database들은 발현정보 뿐만 아니라, 발현정보를 분석하는 분석프로그램을 제공하는데, 이러한 통계적 분석은 표적 유전자를 뽑기 위해 1차적으로 중요하다. 데이터 표준화, 유의 유전자 탐색법, 군집분석, 분류분석 및 생존분석은 expression profile을 분석하기 위해 일반적으로 많이 쓰이는 방법들이다. 다양한 통계분석법 중 multi-platform expression profile에 가장 적절한 통계분석법을 찾고 이를 통계분석 모듈로 개발하고자 한다.
활발하게 이용되고 있는 R 통계분석프로그램은 각종 생물 정보 통계법을 사용하기 쉽게 프로그램화 하여 함수로 제공하고 있으며, 사용자 정의 함수 프로그래밍 및 그래픽의 지원이 원활할 뿐 아니라 무료로 사용할 수 있다. R을 이용하여 muti-platform expression profiles울 분석하여 1차 screening을 자동적으로 수행하는 통계모듈을 개발하고자 한다.

Protein structure, Drug, Chemical compound 에 대한 전문적 정보 연결
실제 항암제는 단백질 수준에서 작용하게 되지만, 단백질 단위의 transcriptome 발현 정보를 얻기가 어렵기 때문에, 대부분의 표적 유전자 screening은 mRNA 발현량 정보에서 시작된다. 통계적 분석을 통해 선택된 mRNA level의 표적 후보 유전자들 중 경쟁력 있는 표적유전자를 선출해 내는 것은 매우 중요한 일이다. 실제, 통계분석을 수행결과로 유의하게 발현된 유전자들의 개수는 많게는 수천 개에서 적게는 수백 개이다. 통계분석을 통해 1차적으로 screen된 후보유전자들을 모두 실험적으로 확인하는 것은 거의 불가능하며, 소수의 핵심 유전자를 선택해야만 한다. 경쟁력 있는 표적유전자를 발굴하는 것은 표적 유전자 후보군에 대한 단백질 구조, pathway분석, 관련 선행연구 등을 치밀하게 분석해야 가능하다.
단백질에서 구조와 기능은 매우 높은 상관성이 있다. 표적유전자에 대한 구조적 지식이 충분할수록 그 기능을 유추하기 쉽고 효율적인 항암물질 개발 역시 도모할 수 있는 것이다. 각종 단백질 구조 데이터베이스와 분석 프로그램이 활발하게 개발되고 있으며, 이러한 정보를 유용하게 이용하면 mRNA 수준의 표적유전자를 단백질 수준의 분석까지 가능케 할 것으로 기대된다. 대표적인 단백질 구조관련 데이터베이스인 Protein DataBase(PDB) 및 ExPAS에서 제공하는 관련정보를 연결하여 경쟁력 있는 표적유전자를 선출에 도움을 주고자 한다. 구조에 대한 예측과 더불어 표적유전자와 결합할 수 있는 ligand, chemical compound에 대한 정보까지 연결하고자 한다.

2. Tissue Microarray imaging DB 구축, image 분석프로그램개발 및 image 정보 서비스
1950년대에 DNA의 존재가 밝혀지면서 시작된 분자생물학은 이전의 생물학에 대한 인식을 바꾸었고, 분자수준의 생물체 연구를 위한 각종 첨단 방법들이 고안되어왔다. 특히 high-throughput screening 과bio-imaging은 앞으로 생물현상 연구의 구심점이 될 것으로 기대되고 있다. high-throughput screening은 expression sequence tag부터 출발하여Serial Analysis of Gene Expression (SAGE)와 DNA microchip까지 발전에 발전을 거듭해오고 있으며, 생물학, 화학, 전산, 통계를 아우르는 총체적 학문의 장을 열고 있다. Bio-imaging은 많은 전문가들이 차세대 성장 동력으로 손꼽은 분야로서 image가 가지는 high-quality 정보의 중요성이 날로 중요해지고 있는 생물, 의학 계통의 핵심 기술로 떠오르고 있다. 특히 bio-imaging 기술과 정보는 상업적 응용가능성이 무궁무진하여 경제적인 측면의 관심도 또한 매우 높다.
대용량의 정보를 분석하기 위한 시스템과 bio-image 기술 및 정보는 생물학 관련 연구의 필수요소로 자리 잡고 있으나, 각종 학문을 유기적으로 융합하기 위한 전문가 및 시설이 부족한 실정이다. Tissue Microarray imaging DB 구축 및 자동분석화 시스템 구축은 분자생물학, 전산프로그래밍, 네트워크 및 엔지니어링 등 각 분야의 협동에 의한 연구로서 암 조직에 대한 high-quality의 image 생성 및 분석 시스템 구축을 목적으로 하고 있다. 빠르게 발전하는 생물, 의학, 전산 등의 기술을 받아들이고 응용하여 항암제 개발을 위한 초석을 마련하고자 한다.

Tissue Microarray 란?
Tissue Microarray (TMA)는 paraffin block에 조직의 일부를 심어서 제작한 것으로 수십개의 표본의 조직들을 하나의 paraffin block에 심을 수도 있다. 수십개의 표본조직이 심어진 paraffin block을 array block이라고 하며, 이를 얇게 slice 하여 각종 IHC stain을 수행하면 관심 있는 유전자의 발현량을 측정할 수 있다.
기존의 histologic section은 하나의 tissue biopsy에 대해 최대 100여 번의 assay가 가능한 반면, TMA는 수 천 번 이상의 assay를 가능하게 한다 (예로50 needle biopsy 가 가능한original tissue block의 경우, 4μm로 slice할 경우 1개의 needle biopsy당 평균 200여장의 slide가 제작됨, 즉, 50x200=1000 가지의 array가 가능함). 특정 유전자에 대한 발현량을 통계적으로 분석하기 위해서는 최소한 200가지 이상의 조직표본이 필요한데, 한정된 조직표본을 최대한 활용하여 다양한 유전자에 대한 대량의 발현량 정보를 얻을 수가 있다.
기존의 개별적 immuno-histochemical staining은 실험적bias를 조정하기 어려웠던 반면, 여러 개의 조직표본이 하나의 array에 구성된 TMA는 동일한 환경에서 stain 과정이 수행됨으로써 실험적 bias를 줄일 수 있는 장점이 있다. 뿐 만 아니라, 기존의 staining에 필요한 reagent 양보다 훨씬 적은 양을 필요로 하여 경제적인 측면에서의 이점도 크다.
이 방법은 수백 장의 슬라이드를 가공하고 염색해야 하는 기존의 방법에 비해서, 단지 한 장 또는 수 장의master slide를 분석함으로써 보다 큰 규모 집단의 연구를 가능케 하고, 모든 표본들을 동일 환경에서 한번에 가공할 수 있으며, 더욱이 연구에 필요한 조직의 양을 줄임으로서 다른 연구나 진단을 위해 표본을 보존할 수 있는 장점이 있다.

omics 정보의 중요성
현재 활발한 항암제 개발에 가장 큰 걸림돌 중의 하나는 항암제 표적유전자를 찾는 것이다.



각종 -omics기반의 유전체 연구가 활발히 진행되고 있으나 경쟁력 있는 표적유전자를 찾는 데는 여전히 어려움이 많다. 현재 활발하게 진행되는 유전체정보가 mRNA수준의 데이터이며, 이는 실질적인 유전자의 기능을 나타내는 단백질 수준의 검증이 뒷받침되었을 때 의미가 있다. 따라서 단백질 수준의 -omics 연구의 중요성은 신약개발에 있어 매우 활용도가 높은 유용한 정보임은 두말할 필요가 없다.
단백질 수준에서 항암 표적유전자를 찾고 검증하는 첫걸음은 암세포와 정상세포에서의 특정 유전자의 단백질 발현량을 비교해보는 것이며, 임상정보와 연동되었을 때 정보의 가치는 더욱 높아진다. Tissue microarray는 다수의 조직으로부터high-throughput으로 단백질 발현량을 측정하는 것으로, 앞으로 경쟁력있는 중요유전자를 screen 및 validation하는 데 유용하게 이용될 것으로 기대된다.


Tissue microarray 자동 image 생성, 데이터베이스 구축, 이미지 분석프로그램 및 image 정보 서비스 네트워크 개발
Tissue Microarray(TMA)는 하나의 슬라이드위에 여러 종류의 조직샘플을 붙여놓음으로써 IHC, ISH 등에 의한 gene expression을 한 번에 관찰할 수 있는 high throughput 개념의 조직 슬라이드를 말한다. TMA상의 각 core들은 각기 다른 샘플로부터 얻은 조직절편으로서 조직별 단백질 발현패턴을 연구할 수 있는 중요한 자료이다. IHC staining에 의한 조직의 암세포 관찰 및 특정 단백질의 발현정도는 숙련된 병리학자에 의해 분석되어왔다. 아무리 숙련된 병리학자라도 개인별 편차가 존재하고 과중한 분석업무에 의한 분석정확도가 떨어지는 문제점이 지적되어오고 있다. TMA의 core별 이미지를 생성하여 저장함으로써 이미지정보가 보다 많은 병리학자에 의해 시간과 공간적 제약 없이 분석될 수 있으며, 이미지 정보가 문서화, 조직화되어 대량분석을 위한primary database로 유용하게 사용될 수 있을 것으로 본다.
TMA image 정보의 저장과정을 기계화하여 보다 규격화된 이미지 정보를 생성하고 이미지생성량을 늘리고자 한다. TMA 이미지 생성을 위한 자동 focusing 과 카메라기능이 탑재된 고성능 고기능 현미경을 제작하였고, 반 자동화된 TMA slide 이미지 생성 라인을 구축하고자 한다.
TMA의 core에 대한 high-quality 이미지를 생성하고 이를 환자정보와 연동시킴으로써, TMA image 정보가 체계적으로 관리될 수 있으며, 중요한 임상정보저장 및 응용분야의 기반을 마련하고자 한다.